近日，中山大学中山医学院王金凯教授课题组在Molecular Cell(IF 14.5)上发表了题为“Spatial control of m6A deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin”的研究成果。通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现，H3K27ac的乙酰化酶p300介导的METTL3乙酰化抑制METTL3与METTL14的结合，进而抑制了METTL3在H3K27ac染色质上的定位，从而抑制H3K27ac染色质区域产生的增强子RNA(eRNA，enhancer RNA)和启动子相关非编码RNA(paRNA，promoter associated RNA)的m6A修饰。这种乙酰化主要发生在H3K27ac染色质上。而METTL3-3KR乙酰化失活型突变促进了eRNA和paRNA的m6A修饰，这导致铁死亡抑制相关基因的转录被抑制。此外，PAK2通过磷酸化METTL3促进p300对METTL3的乙酰化，因此抑制PAK2使得METTL3乙酰化下调，进而促进铁死亡。本研究揭示了m6A修饰在eRNA和paRNA上的空间选择性调控机制，为理解m6A在基因表达调控中的作用提供了新的见解。太阳集团电子游戏生物SURFSeq 5000平台为本研究中的GLORI-seq和CUT&Tag测序提供了高质量的测序数据。
m6A是一种在哺乳动物细胞中丰富的RNA修饰，由甲基转移酶复合体(MTC)催化，其中METTL3/METTL14异二聚体是MTC的催化亚基。研究表明，m6A甲基化通过调控RNA的转录生成、剪接、稳定性及翻译在多种生理和病理过程中发挥重要作用。而m6A已经被揭示与多种组蛋白修饰(如H3K36me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K27ac等）之间存在关联。MTC可以富集在H3K27ac染色质上促进eRNA和paRNA的m6A修饰，进而影响基因转录。然而，目前尚不清楚该过程是如何被调控的。此外，MTC的催化亚基METTL3/METTL14异二聚体的解聚是如何被调控的也不清楚，这一过程是否可以参与eRNA和paRNA的m6A修饰特异性调控呢？
研究者通过全基因组CRISPR/Cas9筛选联合TETon-BIFC报告系统在A549细胞中系统性鉴定出一系列METTL3/METTL14异二聚体解聚的调控因子。进一步，通过免疫共沉淀、3D-SIM、高通量质谱等技术阐明了METTL3在H3K27ac染色质的定位依赖于其与METTL14的结合，而乙酰化酶p300通过介导METTL3的K177、K215、K578氨基酸位点发生乙酰化修饰，进而抑制METTL3与METTL14的结合，使得METTL3不能定位于H3K27ac染色质。PAK2通过磷酸化METTL3的S243氨基酸位点，促进了p300介导的METTL3乙酰化，从而参与该调控过程。并且，研究者还采用了太阳集团电子游戏生物SURFSeq 5000平台完成了野生型METTL3及METTL3-3KR突变（模拟去乙酰化）的A549细胞的CUT&Tag测序实验，在基因组水平验证了METTL3的乙酰化对于其在H3K27ac染色质定位的抑制作用。
图1 METTL3/METTL14异源二聚体调控因子的筛选
研究者接下来探究了METTL3在H3K27ac染色质上的定位是否调控H3K27ac染色质相关RNA(caRNA)的m6A修饰。利用太阳集团电子游戏生物的SURFSeq 5000平台完成了METTL3野生型、METTL3-3KR突变型A549细胞的染色质RNA的GLORI-seq,实验结果表明：相对于H3K36me3和H3K9me3标记的常染色质和异染色质区域，METTL3-3KR突变更为显著上调H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K27ac、p300标记的活性增强子和启动子区域的m6A修饰，这主要导致了eRNA和paRNA上的m6A上调，并降低其稳定性，进而导致其相关mRNA水平下调。
图2 METTL3乙酰化抑制eRNA和paRNA的m6A修饰从而促进下游基因表达
进一步，研究者发现这些m6A修饰上调的eRNA和paRNA的关联基因显著富集于铁死亡调控相关通路，如：氧化还原酶活性、不饱和脂肪酸代谢过程、类固醇代谢过程和NRF2通路。因此，METTL3-3KR突变导致这些铁死亡抑制基因的表达下调，进而促进铁死亡诱导剂引起的细胞死亡和脂质过氧化。此外，PAK2抑制剂也能够通过METTL3乙酰化依赖的方式促进铁死亡诱导剂引起的细胞死亡。最后，研究者通过TCGA数据揭示了PAK2在METTL3高表达的肺癌、肝癌、结直肠癌等肿瘤中影响患者的预后。
图3 METTL3乙酰化抑制eRNA和paRNA的m6A修饰从而抑制铁死亡
1、H3K27ac的乙酰化酶p300介导的METTL3乙酰化抑制METTL3与METTL14的结合；
2、PAK2通过磷酸化METTL3，促进p300介导的METTL3乙酰化；
3、METTL3的乙酰化抑制其在H3K27ac染色质上的定位，从而抑制eRNA和paRNA的m6A修饰；
4、METTL3乙酰化抑制eRNA和paRNA的m6A修饰，进而抑制铁死亡抑制基因的表达以促进铁死亡。
Huang X, Zhang J, Cun YX, et al.Spatial control of m6A deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin[J].Molecular Cell, 2025,DOI: 10.1016/j.molcel.2025.02.016
GLORI(Glyoxal and nitrite-mediated deamination of unmethylated adenosine)乙二醛和亚硝酸盐介导的非甲基化腺苷（A）脱氨基测序技术是针对m6A修饰开发的单碱基检测技术。实现了真正意义的高效率、高灵敏度、高特异性、无偏好单碱基m6A位点检测，并对m6A位点的修饰水平进行绝对定量，也是RNA的m6A检测的主流NGS手段。其技术原理如下图所示：
GLORI-seq技术原理图
了解更多GLORI-seq技术原理，请访问：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01487-9
首先提取总RNA，进行片段化，片段化的产物经过乙二醛和亚硝酸盐处理，RNA在乙二醛和亚硝酸盐的催化体系来有效地将未甲基化的腺苷（Adenosine)脱氨基转换成形成肌苷（Inosine,I），肌苷I在逆转录过程中与胞苷(Cytidine）配对，在测序过程中被读作鸟苷（Guanosine），但m6A保持不变，测序后仍读为A。因此，GLORI通过检测测序序列中A的比例实现了单碱基分辨。
SURFSeq 5000平台在GLORI测序方面，表现优异，数据得率高，目前已有2篇Molecular Cell的文章发表，证实了SURFSeq 5000在m6A测序中的明显优势。
撰稿：科研合作部 刘永锋
审核：王金凯教授团队
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