近日，太阳集团电子游戏生物在Genomics, Proteomics & Bioinformatics（IF11.5,Genetics & Heredity JCR Q1）上发表了题为“A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications”的研究成果。该研究介绍了太阳集团电子游戏生物GenoCare 1600系列单分子基因测序平台的双色荧光测序化学原理，并完成了大肠杆菌标准样品测序，下机数据一致序列的准确率达到99.99%。研究者还评估了GenoCare 1600在微生物混合物和新冠患者咽拭子样本上的检测性能。研究结果表明：GenoCare 1600可以完成微生物的定量，灵敏地识别新冠状病毒，并能准确检测病毒的突变位点（通过Sanger测序验证），以上性能显示了其优秀的临床应用潜力。
过去二十年，DNA测序技术已成为科研和诊断领域的关键工具。人类基因组计划的完成，高通量测序技术（next-generation sequencing, NGS）取得了突飞猛进的发展，尤其是基于边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的技术。与此同时，单分子测序技术（Single-molecule sequencing）也取得显著突破，如：Pacific Biosciences采用零模波导检测单个DNA聚合酶延伸发出荧光信号的single-molecule real-time、Oxford Nanopore Technologies的纳米孔测序技术。虽然这两种测序技术产生的reads更长（>10 Kb），但因测序通量低（单个run下机reads数少）、试剂成本高以及实验繁琐等因素大大限制其在临床上的应用。
经过72 cycles，双色反应系统的read长度就达到约41 nt，比单色反应系统120 cycles的read长了2 nt，均能产出10 M reads，而且整体错误率比单色更低。实验操作方面，文库构建步骤少，时间短，DNA文库1.5 h (图1A)，RNA文库2.8 h (图1B)。
简单基因组（phi X174 噬菌体）测序，24 h获得了334.3 M reads，平均每条lane的数据量为20.9 M unique reads，变异系数为4.5%。模式物种大肠杆菌，全基因测序需要15 h，丰度最高的reads为70 nt，平均测序读长53 nt（图2A）。平均每条lane的数据量为12.2 M，仅有0.61%的mismatch，1.45%的插入错误，2.76%的缺失错误。整体测序深度为130×（图2B），基因组覆盖率为99.94%，一致序列准确度为99.99%。为了模拟临床样本的病原微生物检测，研究者混合了大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、M13噬菌体、酿酒酵母以及人源DNA，并将GenoCare 1600的测序结果与高通量测序平台Hiseq 4000与qPCR得到的结果进行比较。结果显示：GenoCare 1600检测M13噬菌体含量在10－6到10－3时与理论浓度一致，优于qPCR。
既然，GenoCare 1600在检测单一噬菌体、细菌以及混合的微生物样本方面都表现出优异性能，那么，该平台能用于新冠病毒的溯源研究吗？研究人员采集了3例新冠阳性患者和一名健康志愿者的咽拭子。对于阳性样本，GenoCare 1600测序得到的超过5万条reads可以比对到新冠病毒的基因组，覆盖了整个基因组99.9%的区域。此外，检测得到的突变位点，均经过Sanger测序方法进行了验证，其中位于ORF8（location 28144）的T-C突变被确认为当时流行的新冠病毒株特有突变位点。
1. 双色测序化学提升了单分子测序的效率，相对于单色，cycle数更少，read更长；
2. GenoCare 1600测序平台可以快速并准确检测病原细菌和RNA病毒；
3. GenoCare 1600测序平台可以准确检测新冠病毒的突变位点；
4. 单分子测序平台操作简便，对于缺少NGS测序经验的临床机构更为友好。
Chen F, Liu B, Chen M, et al. A Two-color Single-molecule Sequencing Platform and Its Clinical Applications[J]. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2024: qzae006.