中药资源是中药产业发展的基础，中药资源研究方法正逐步形成以分子生物学、生物信息学及计算机科学等为主要研究手段的多学科交叉体系。众所周知，中药方剂化学成分复杂，难以找到单一作用靶点，阐明可能的药理，而转录组学可以对药物干预机体的分子变化进行多维度、多靶点的描绘，以弥补单基因研究的不足，全面揭示药理机制，从而为方药有效成分的筛选、新药的发现以及优良种质资源的培育奠定基础，为中西医结合治疗提供数据支撑。

近日，太阳集团电子游戏生物的合作单位绍兴市妇幼保健院在《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》杂志上发表了题为“Inhibition of Hepatitis B Virus (HBV) replication and antigen expression byBrucea javanica(L.) Merr. oil emulsion”的研究成果。该研究结合分子生物学实验及高通量测序证实：鸦胆子（Brucea javanica(L.) Merr.）油乳剂（BJOE）对人乙型肝炎病毒（HBV）的复制和抗原表达存在明显的抑制作用，且这种作用是通过上调白细胞介素6（IL-6）实现的，揭示了其潜在的抗病毒机理。基于太阳集团电子游戏生物GenoLab M高通量基因测序平台对BJOE处理前后的肝癌细胞系HepG2进行转录组测序，进一步确定BJOE对肝癌细胞中IL-6基因的影响。本研究为BJOE的HBV临床治疗潜力提供了新的见解，也说明对于真实样本的转录组测序，GenoLab M表现依然优秀，获得学术界的认可。

*以下为该研究成果解读

背景简介

乙型肝炎病毒（HBV) 感染是目前全球最主要的健康卫生问题之一，慢性HBV感染是导致肝硬化、肝衰竭及肝细胞癌发生的重要原因。据世卫组织统计：2019年，全球有2.96亿人患有慢性乙肝感染，且每年有150万新发感染者，对公共安全造成很大威胁。HBV是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科，包括三种重要的免疫标记物，也是HBV病毒组装的三个重要组成成分：HBsAg（乙肝表面抗原），HBeAg（乙肝e抗原），HBcAg（乙肝核心抗原）。目前，抗HBV治疗药物主要有两类：α干扰素（IFN-α）和核苷类似物NAs（如lamivudine：中文名拉米夫定，简称LMV）。前者通过直接抗病毒、免疫调节和抗增殖作用发挥抗病毒活性；后者通过模拟生理核苷，靶向HBV逆转录酶，有效抑制病毒DNA复制。但是，由于耐药突变的不断出现、病毒载量的提高及血清中转氨酶的增加，会导致抗HBV药物的疗效显著降低。因此，HBV治疗仍然面临巨大的挑战。

鸦胆子是盛产于我国南方的一种中药材，味苦、性寒、微毒，被报道对多种疾病具有良好的治疗效果，包括癌症、疟疾、痢疾及胃溃疡等。鸦胆子种子提取的重要成分，具有显著的抗植物病毒活性。然而，鸦胆子是否能抗HBV，如能，这种抗性的机制又是怎样的呢？目前尚无报道。本文通过大量的体外实验，研究鸦胆子油乳剂对HBV体外复制、抗原表达及细胞因子分泌的作用，证实其对乙型肝炎的临床治疗潜力，并阐明其可能的抗病毒作用机制。

结果概要

01 研究框架

本研究使用三种肝癌细胞系：Huh7，HepG2以及HepG2.2.15（由HepG2改造而来，可以稳定表达HBV亚复制子和病毒抗原），Huh7和HepG2体外转染HBV-WT（野生型）或HBV-LMV-MT（抗拉米夫定突变型）复制子质粒以实现HBV的稳定复制和抗原表达。使用不同剂量的BJOE处理细胞，通过细胞活性检测、qRT-PCR（实时荧光定量PCR）、CMIA（化学发光微粒子免疫测定）、Western Blot（蛋白免疫印迹）、FCM（流式细胞术）以及RNA-seq（转录组测序）等技术手段，确定BJOE的抗HBV作用机制。

02 BJOE对细胞活力的影响

该研究首先检测在不同的剂量浓度和时间梯度下，BJOE对肝癌细胞活力的影响，以确定合适的BJOE使用浓度，用于后续抗病毒实验，以避免BJOE对细胞产生毒性作用。通过CCK-8实验（细胞增殖和细胞毒性检测）证实（Figure 1E-G）：BJOE≤5 mg/ml，作用时间24小时和48小时，均不会造成肝癌细胞活力的明显改变，故后续研究中BJOE使用的最大浓度为5 mg/ml。

随后，研究人员使用BJOE处理HepG2.215，以及转染HBV-WT的HepG2和Huh7细胞。通过qRT-PCR检测发现，与拉米夫定抑制病毒复制的结果类似，BJOE可以有效降低HBV的复制水平，尤其在5 mg/ml使用浓度时，约40%的HBV复制被抑制（Figure 2A-C）。CMIA检测细胞上清中HBsAg和HBeAg，Western Blot检测HBcAg表达水平，结果表明：三种乙肝病毒抗原在BJOE处理后，都呈现明显的下调，而拉米夫定对HBV抗原表达没有影响（Figure 2D-H）。

通过FCM检测BJOE处理后肝癌细胞上清中细胞因子的水平，发现BJOE显著增强HepG2和Huh7细胞中IL-6的分泌，但在HepG2.215细胞中，作用并不明显（Figure 3）。为进一步验证BJOE、IL-6和HBV的关系，对转染HBV-WT质粒的HepG2和Huh7细胞分别使用BJOE和DMSO（二甲基亚砜）处理，检测上清中细胞因子的水平，结果表明：DMSO显著下调IL-6的水平，与其促进病毒复制的作用一致；而BJOE显著上调IL-6的水平，结合上述BJOE抑制HBV复制和抗原表达的结果，我们推测BJOE通过上调IL-6从而发挥抗病毒作用（Figure 4A-B）。研究人员为验证上述推测，对HBV-WT转染的HepG2和Huh7细胞，外源加入重组IL-6后，发现两种细胞中HBV的复制及抗原表达均被明显抑制，说明IL-6的上调可以直接抑制HBV的转录和复制，而这种上调是BJOE刺激引起的（Figure 4C-D）。

为进一步探讨BJOE对肝癌细胞中IL-6转录水平的影响，研究人员对BJOE处理的HepG2细胞进行了转录组测序。结果表明：BJOE导致HepG2细胞中IL-6基因上调，且IL-6作为关键基因，在细胞内与多种基因存在相互作用。在GO富集通路中，IL-6广泛参与肝脏相关的生物学过程，包括肝细胞增殖和形态发生，以及肝脏功能实现（Figure 5）。

HepG2/Huh7细胞转染HBV-WT或HBV-LMV-MT质粒后，使用BJOE或拉米夫定处理细胞，然后通过qRT-PCR及FCM检测HBV的复制及抗原表达。结果表明，5 mg/ml BJOE可以有效抑制WT和LMV-MT的复制，以及HBV抗原的表达；而LMV仅对WT有效，对突变型无效。当两者联合使用时，抗病毒效应被加强（Figure 6）。

为进一步探讨鸦胆子单一成分的抗HBV作用，研究人员使用鸦胆子苦醇（brusatol）、鸦胆子碱A（bruceine A）、鸦胆子碱B（bruceine B）、鸦胆亭（bruceantin）和鸦胆子苦味素（bruceantinol）分别处理HepG2和Huh7细胞后，检测上清中细胞因子的水平，结果表明：鸦胆子碱B可以上调IL-6的水平（Figure 7A-B），且在HepG2.215中有效抑制HBV复制和抗原表达（Figure 7C）。

基于上述分析，我们得出如下结论：

1、BJOE可以有效抑制HBV复制及病毒抗原表达；

2、BJOE可以调节IL6的分泌，进而发挥抗病毒作用；

3、BJOE不仅对WT病毒发挥有效的抗病毒作用，对LMV-MT病毒同样有效；

4、在BJOE抗HBV作用中，其活性成分--鸦胆子碱B发挥关键作用。